Durante i tre anni di dottorato ho preso parte a diversi progetti, in cui ho utilizzato l’organismo modello di zebrafish per capire il ruolo di diverse proteine della matrice extracellulare nel regolare le vie di trasduzione del segnale. Il mio primo progetto di dottorato ha riguardato lo studio di funzione della proteina della matrice extracellulare Emilina3 nel modello animale di zebrafish, al fine di comprendere appieno il ruolo biologico di questa glicoproteina nello sviluppo embrionale e nell’omeostasi tissutale. In particolare ho contribuito agli esperimenti in vivo, sfruttando tecniche di forward genetic, che dimostrano come Emilina3, componente della matrice extracellulare che sta attorno alla notocorda, è necessaria non solo per la corretta maturazione della notocorda ma anche e per la regolazione dei segnali di Hedgehog derivanti dalla notocorda stessa. Inoltre, ho contribuito agli esperimenti in vitro che hanno permesso di comprendere come Emilina3 limiti i segnali di Hedgehog secreti dalla notocorda: questa proteina è in grado di interagire e sequestrare un fattore secreto che agisce in maniera permissiva nel rilascio dei ligandi di Hedgehog, Scube2. In questo contesto, ho generato diversi costrutti di Emilina3 e Scube2, deleti nei loro diversi domini, necessari per saggi di legame in vitro che hanno permesso di comprendere che Emilina3 è in grado di interagire specificatamente con le ripetizioni EGF di Scube2. Nel complesso, questo studio ha stabilito per la prima volta come l'interazione tra Emilina3 e Scube2 nella membrana basale della notocorda è fondamentale per la corretta attività di patterning della notocorda stessa. Tali ricerche sono state oggetto di pubblicazione (Corallo et al., Development 2013). A margine di questo lavoro, le attività di documentazione e studio delle più recenti scoperte riguardo la notocorda hanno portato all’elaborazione di due reviews sull’argomento (Corallo et al., CMLS 2015; Corallo et al., JCS in preparazione). A partire dal secondo anno di dottorato, ho utilizzato il modello animale di zebrafish per avviare in maniera indipendente studi funzionali, volti a comprendere il ruolo del collagene VI durante lo sviluppo embrionale. Numerosi studi precedentemente effettuati dal nostro gruppo sui topi privi di collagene VI (Col6a1 knockout) hanno rivelato un ruolo cruciale di tale componente della matrice extracellulare nell’omeostasi dei tessuti, ed in particolare di quello muscolare. Tali studi dimostrano che il deficit di collagene VI determina l’insorgenza di una sindrome miopatica a carico dei muscoli, caratterizzata da apoptosi spontanea, alterazioni agli organelli e deficit di autofagia nelle fibre muscolari. Analoghe alterazioni sono state evidenziate nei muscoli dei pazienti affetti da miopatia di Bethlem e distrofia di Ullrich, due patologie umane legate a mutazione dei geni codificanti per il collagene VI. Il mio progetto è nato da queste premesse: l'obiettivo è comprendere appieno, in assenza del collagene VI, quali alterazioni tissutali e molecolari avvengono utilizzando l’organismo modello di zebrafish In particolare, ho condotto una caratterizzazione della struttura, dell'organizzazione genica e dell'espressione delle catene del collagene VI nell’organismo modello di zebrafish. Tutte queste informazioni sono alla base per studi funzionali. In particolare, attraverso il silenziamento genico mediato da morfolino del collagene VI in diverse linee transgeniche reporter di zebrafish, ho iniziato a indagare quali vie di segnalazione e tessuti sono affetti dall'assenza di questa importante componente della matrice extracellulare. In particolare ho individuato non solo un’alterazione dello sviluppo delle fibre muscolari, ma anche un difetto di crescita assonale dei motoneuroni negli embrioni morfanti per il collagene VI. Inoltre, ho anche osservato un’alterazione nelle vie di segnale di Wnt e BMP; e in futuro si prospetta di trovare una correlazione tra le alterazioni di sviluppo dei tessuti e quelle delle vie di segnale. In parallelo, ho applicato con successo la nuova tecnica di mutagenesi sito-specifica CRISPR/Cas9, generando una linea di zebrafish priva di collagene VI, al fine di confermare ed estendere i risultati ottenuti. Questi studi sono di particolare rilievo, in quanto per la prima volta indagano alterazioni finora sconosciute dei meccanismi molecolari legati a deficit di collagene VI, aprendo così la strada ad ulteriori studi nei pazienti affetti da patologie legate al collagene VI.

Investigating the role of extracellular matrix in regulating signaling pathways and embryonic development

TRAPANI, VALERIA
2016

Abstract

Durante i tre anni di dottorato ho preso parte a diversi progetti, in cui ho utilizzato l’organismo modello di zebrafish per capire il ruolo di diverse proteine della matrice extracellulare nel regolare le vie di trasduzione del segnale. Il mio primo progetto di dottorato ha riguardato lo studio di funzione della proteina della matrice extracellulare Emilina3 nel modello animale di zebrafish, al fine di comprendere appieno il ruolo biologico di questa glicoproteina nello sviluppo embrionale e nell’omeostasi tissutale. In particolare ho contribuito agli esperimenti in vivo, sfruttando tecniche di forward genetic, che dimostrano come Emilina3, componente della matrice extracellulare che sta attorno alla notocorda, è necessaria non solo per la corretta maturazione della notocorda ma anche e per la regolazione dei segnali di Hedgehog derivanti dalla notocorda stessa. Inoltre, ho contribuito agli esperimenti in vitro che hanno permesso di comprendere come Emilina3 limiti i segnali di Hedgehog secreti dalla notocorda: questa proteina è in grado di interagire e sequestrare un fattore secreto che agisce in maniera permissiva nel rilascio dei ligandi di Hedgehog, Scube2. In questo contesto, ho generato diversi costrutti di Emilina3 e Scube2, deleti nei loro diversi domini, necessari per saggi di legame in vitro che hanno permesso di comprendere che Emilina3 è in grado di interagire specificatamente con le ripetizioni EGF di Scube2. Nel complesso, questo studio ha stabilito per la prima volta come l'interazione tra Emilina3 e Scube2 nella membrana basale della notocorda è fondamentale per la corretta attività di patterning della notocorda stessa. Tali ricerche sono state oggetto di pubblicazione (Corallo et al., Development 2013). A margine di questo lavoro, le attività di documentazione e studio delle più recenti scoperte riguardo la notocorda hanno portato all’elaborazione di due reviews sull’argomento (Corallo et al., CMLS 2015; Corallo et al., JCS in preparazione). A partire dal secondo anno di dottorato, ho utilizzato il modello animale di zebrafish per avviare in maniera indipendente studi funzionali, volti a comprendere il ruolo del collagene VI durante lo sviluppo embrionale. Numerosi studi precedentemente effettuati dal nostro gruppo sui topi privi di collagene VI (Col6a1 knockout) hanno rivelato un ruolo cruciale di tale componente della matrice extracellulare nell’omeostasi dei tessuti, ed in particolare di quello muscolare. Tali studi dimostrano che il deficit di collagene VI determina l’insorgenza di una sindrome miopatica a carico dei muscoli, caratterizzata da apoptosi spontanea, alterazioni agli organelli e deficit di autofagia nelle fibre muscolari. Analoghe alterazioni sono state evidenziate nei muscoli dei pazienti affetti da miopatia di Bethlem e distrofia di Ullrich, due patologie umane legate a mutazione dei geni codificanti per il collagene VI. Il mio progetto è nato da queste premesse: l'obiettivo è comprendere appieno, in assenza del collagene VI, quali alterazioni tissutali e molecolari avvengono utilizzando l’organismo modello di zebrafish In particolare, ho condotto una caratterizzazione della struttura, dell'organizzazione genica e dell'espressione delle catene del collagene VI nell’organismo modello di zebrafish. Tutte queste informazioni sono alla base per studi funzionali. In particolare, attraverso il silenziamento genico mediato da morfolino del collagene VI in diverse linee transgeniche reporter di zebrafish, ho iniziato a indagare quali vie di segnalazione e tessuti sono affetti dall'assenza di questa importante componente della matrice extracellulare. In particolare ho individuato non solo un’alterazione dello sviluppo delle fibre muscolari, ma anche un difetto di crescita assonale dei motoneuroni negli embrioni morfanti per il collagene VI. Inoltre, ho anche osservato un’alterazione nelle vie di segnale di Wnt e BMP; e in futuro si prospetta di trovare una correlazione tra le alterazioni di sviluppo dei tessuti e quelle delle vie di segnale. In parallelo, ho applicato con successo la nuova tecnica di mutagenesi sito-specifica CRISPR/Cas9, generando una linea di zebrafish priva di collagene VI, al fine di confermare ed estendere i risultati ottenuti. Questi studi sono di particolare rilievo, in quanto per la prima volta indagano alterazioni finora sconosciute dei meccanismi molecolari legati a deficit di collagene VI, aprendo così la strada ad ulteriori studi nei pazienti affetti da patologie legate al collagene VI.
gen-2016
Inglese
extracellular matrix, notochord, Emilin3, Hedgehog, signaling, Collagen VI, zebrafish, development, CRISPR/Cas9
COSTA, RODOLFO
Università degli studi di Padova
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14242/118306
Il codice NBN di questa tesi è URN:NBN:IT:UNIPD-118306