Binomio Chitina-Chitinasi in popolazioni indigene andino-amazzoniche del Perù

La chitina è un polisaccaride-azotato insolubile presente in strutture di patogeni dell’Uomo e in alimenti come artropodi e funghi (Muzzarelli et al., 2011). Gli esseri umani hanno due chitinasi enzimaticamente attive, codificate da due geni paraloghi: Chitotriosidasi (CHIT, gene CHIT1) e Acidic Mammalian Chitinase (AMCase, gene CHIA). CHIT ha massima attività enzimatica a pH 6, si esprime nei macrofagi, ed è sovra-espressa durante infezione malarica, pertanto prende parte alla risposta immunitaria innata (Musumeci et al., 2005). È interessante notare che la deficienza enzimatica di CHIT1 (dovuta ad una duplicazione di 24 bp sull’esone 10 di CHIT1) è frequente in molte popolazioni umane, e assente negli altri primati (Gianfrancesco & Musumeci, 2004), suggerendo che la funzione chitinolitica, per questa chitinasi, potrebbe essere ridondante nell’uomo (Piras et al., 2007). AMCase è espressa prevalentemente in cellule epiteliali, e sovra-espressa in macrofagi specializzati attivati durante risposte immunitarie umorali Th2 (T-helper di tipo 2) a infezioni da elminti parassiti e durante risposte asmatiche a particelle di chitina, suggerendo che AMCase mantiene la funzione immunologica e prende parte a disturbi del sistema immunitario come atopie ed asma (Reese et al., 2007). AMCase si esprime anche nello stomaco, ma non nel duodeno e nell'intestino (Boot et al, 2005). Infine, esercita attività enzimatica a pH 2 , 4.6 e 7, caratteristici di stomaco, lisosomi e polmoni, rispettivamente (Seibold et al, 2009), difatti le secrezioni gastriche umane esercitano attività chitinolitica dovuta a AMCase (Paoletti et al, 2007; Cozzarini et al, 2009). Obbiettivi Studiare il binomio chitina-chitinasi in comunità native dell’Amazonia e Ande del Perú, che vivono in condizioni di elevata esposizione a chitina ambientale, rispetto a un gruppo controllo di popolazione urbanizzata. Descrivere due dei principali fattori di esposizione alla chitina: la dieta e gli elminti. Con un approccio evoluzionistico e il supporto di differenti strumenti bioinformatici, verranno discusse le possibili correlazioni tra la variabilità genetica delle chitinasi e la diffusione di parassiti intestinali e distubi associati alle chitinasi, nelle popolazioni mondiali. Metodi Studio etnobiologico descrittivo della dieta tradizionale, soprattutto di insetti e crostacei. Analisi copro-parassitologica per individuazione e determinazione di uova/oocisti/larve in 76 amerindi di origine Awajun, Ashaninka e Shipibo. Analisi statistica di similarità–distanza tra gli Amerindi e casi studio in diverse popolazioni mondiali, in base alla prevalenza di parassiti contenenti chitina (database GIDEON). Genotipizzazione della duplicazione CHIT1 mediante sequenziamento e elettroforesi, in 85 Amerindi e 50 controlli urbanizzati. Sequenziamento del promotore e esone 4 di CHIA (75 Amerindi, e 39 controlli, rispettivemente). Restrizione enzimatica per genetipizzare la variante nota sull’esone 12, in parte del campione. Studio della variabilitá del gene CHIA in 14 popolazioni (database ENSEMBL). Risultati I dati etnobiologici hanno confermato, in Awajún, Ashaninka, Quechua-Lamas, una alimentazione basata sulla biodiversità selvatica, tra cui il consumo giornaliero di insetti, crostacei e funghi; gli Shipibo che vivono a Lima hanno confermato abitudini alimentari tradizionali e consumo di artropodi prima di migrare; i Quechua del Cusco (3000-4000 mslm), consumano saltuariamente larve di coleottero e bruchi. Nelle tre popolazioni interessate dalle analisi parassitologiche (Awajun, Ashaninka e Shipibo), è stata accertata un’elevata prevalenza di enteroparassiti: 35-43% per i nematodi, 35- 61% per i protozoi e 3-29% per Hymenolepis nana (l'unico platyhelminto riscontraro). I parassiti contenenti chitina più frequenti nella popolazione campione erano i protozoi Giardia lamblia, Entamoeba histolitica, e i macro-parassiti Ancylostoma/Necator, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichiuris trichura e Hymenolepis nana. Diversamente, la popolazione di controllo di peruviani urbanizzati presenta abitudini alimentari occidentalizzate e una bassa prevalenza di elminti intestinali (2-12%). L'analisi comparativa della distribuzione di enteroparassiti in popolazioni umane ha dimostrato che gli Amerindi sono esposti a una gamma ridotta di elminti contenenti chitina, e che le specie istozoiche più severe (trematodi, Taenia e filarie) sono assenti in popolazioni dell’Amazzonia peruviana (Ibanez et al., 2004), e nalla banca dati on-line GIDEON. La duplicazione 24 bp che causa la deficienza enzimatica in Chitotriosidasi risultata altamente conservata, con una frequenza di 47.06% negli Amerindi, e 27,55% nei peruviani. Questa frequenza è la seconda più alta al mondo, dopo la popolazione cinese Han (Choi et al., 2001). Le frequenze genotipiche rispettano l’Equilibrio di Hardy Weinberg nelle singole popolazioni, nella popolazione totale (X ² = 0.006, p = 0,939), escludendo la presenza di pressione selettiva per questo allele. Nel gruppo di controllo è stato riscontrato il maggior discostamento dai valori attesi (p = 0,091; significativo con p < 0,05). L’esone 4 di CHIA codifica il dominio catalitico: 3 SNP (A290G, G296A, G339T) sono noti per ridurre l’attività enzimatica a differenti pH. L' aplotipo "AGG", wild-type (WT) negli umani, è conservato anche negli Amerindiani peruviani con una frequenza del 96 % e un alto grado di omologia e omozigosi. Dalla sequenza WT negli Amerindi, sono emerse numerose sostituzioni in loci molto variabili nelle popolazioni umane. In base al confronto con l’allele ancestrale, alla distribuzione delle frequenze alleliche e l’Fst per coppie di polazioni, numerosi polimorfismi a livello del promotore e 5’UTR, e tre varianti non-sinonime (rs2275253, esone 10; re2275254, esone 11; rs2256721, esone 12), risultano fissate nelle popolazioni amerindiane. Discussione Gli studi etnobiologico e parassitologico hanno accertato uno stile di vita tradizionale, fortemente influenzato da fattori ambientali e, in particolare, da un’elevata prevalenza di macroparassiti contenenti chitina e da un intenso consumo di invertebrati selvatici. Tuttavia gli amerindi non conoscono numerose specie di parassiti istozoici: trematodi (Schistosoma e Fasciola), Taenia, e delle filarie, che non sono enteroparassiti, hanno cicli biologici complessi e possono produrre granulomi e fibrosi in diversi organi (fegato, cervello, sistema linfatico, muscoli) (Jackson et al., 2009; Anthony et al, 2007). Anche se i dati raccolti non permettono di realizzare analisi di correlazione tra genotipi e infezioni parassitarie, la deficienza enzimatica di Chitotriosidasi è assolutamente elevata e maggiore rispetto alla popolazione peruviana. Possiamo quindi dedurre che gli enteroparassiti riscontrati non esercitino pressione selettiva in favore di una Chitotriosidasi funzionale, nel nostro campione. Possiamo anche escludere che la Chitotriosidasi funzionale (WT freq.: 72,45%) sià più frequente nella popolazione di controllo in risposta agli enteroparassiti, che sono meno frequenti in aree urbane. Più probabilmente, la migrazione di Europei e Africani dopo la conquista può aver determinato alte frequenze del allele WT nei peruviani non-etnici e in altri paesi centro e sud americani come Messico (76%)(Juárez-Rendón et al., 2012) e Brasile (74%)(Adelino et al., 2010). Questa "mutazione" è assente nei primati e in molte popolazioni africane (Benin: 0%; Burkina Faso: 0,2%) (Piras et al., 2007), mentre mostra le frequenze più alte nelle popolazioni asiatiche: Cinese Han (58%) (Chien et al, 2005); India 40% (Choi et al., 2001), suggerendo che questa variante sia emersa dopo la migrazione dell’uomo dal continente africano (Piras et al., 2007). Consideranto che i primi abitanti del Nuovo Mondo provennero da popolazioni dell'estremo est-asiatico tra 6 e 30 anni fa, è plausibile che le alte frequenze della mutazione (>40%) siano dovute all’effetto del fondatore, e potrebbero dunque essere conservate in tutte le popolazioni indigene del Sud America. Il gene CHIA (esoni e promotore 1000 bp dal 5’UTR) presentano un aplotipo specifico, con molti loci che presentano alta frequenza dell'allele derivato (95%), raro negli Africani e negli Europei (<30%), quindi candidati come loci interessati da pressione selettiva. Tali varianti sono localizzate nella regione del promotore e negli ultimi tre esoni (10, 11 e 12), influenzando la funzionalità del sito de legame. E’ rilevante notare che le tre varianti non-sinonime sono associate a fenotipi asmatici Th2 in Centroamericani ed Europei, suggerendo ulteriori legami tra la co-evoluzione uomo-elminti, la funzionalità di AMCase e disordini immunologici. Si può pertanto ipotizzare che negli Amerindiani sia avvenuta una riqualificazione funzionale che coinvolge l'espressione genica e il sito di legame. Solo il polimorfismo re2275254 (T1218C, Phe354Ser), esone 11, ha alte frequenze dell'allele ancestrale sia in Africa tropicale che in Sud America, e frequenze più basse nelle regioni temperate di Asia ed Europa, che è un cline rilevante di distribuzione geografica per un allele funzionale (Coop et al., 2009), associato alla variazione latitudinale dei principali fattori ambientali, che influenzano la distribuzione dei parassiti.