Pathogenetic role of MFN2 gene: genetic analysis in patients with charcot-marie-tooth neuropathy and disease modeling in zebrafish

Le Charcot-Marie-Tooth (CMT) sono le più comuni patologie ereditarie del sistema nervoso periferico. Il sottotipo CMT2A, uno dei più frequenti, è causato da mutazioni nel gene MFN2, codificante mitofusina 2, una proteina GTPasica, per struttura simile alla dinamina, localizzata a livello della membrana esterna dei mitocondri. MFN2 risulta implicata in diversi processi cellulari, quali la fusione della membrana mitocondriale esterna dei mitocondri, il trasporto di questi lungo gli assoni e il tethering tra mitocondri e reticolo endoplasmatico. Ad oggi sono state identificate più di 80 mutazioni associate alla CMT2A e a varianti complicate di CMT2. Tali mutazioni sono nella maggior parte dei casi mutazioni puntiformi a trasmissione autosomica dominante, ma recentemente sono state identificate anche alcune mutazioni a trasmissione semi-dominante o recessiva. Con lo scopo di identificare nuove mutazioni in mitofusina 2 e individuare una possibile correlazione genotipo-fenotipo, nella prima parte di questo progetto si è proceduto a condurre un’analisi genetica del gene in 25 pazienti con diagnosi di CMT assonale. Tale analisi è stata condotta primariamente mediante sequenziamento diretto degli esoni di cui il gene MFN2 è composto. Successivamente, nei soggetti risultati negativi all’analisi per sequenziamento, si è proceduto ad eseguire un’analisi mediante la tecnica della multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA), la quale consente di identificare eventuali riarrangiamenti genici, non identificabili mediante sequenziamento. L’analisi genetica dei pazienti ha permesso di identificare la mutazione causativa in cinque probandi. In quattro di questi sono state trovate mutazioni in eterozigosi, mentre un paziente affetto da una grave forma di CMT assonale è risultato essere un eterozigote composto per due mutazioni in MFN2 (p.[K38del]+[T362M]). Delle mutazioni così rilevate, quattro (E329del, A738V, R94P, K38del) non risultavano prima descritte. La frequenza delle mutazioni di MFN2 nel campione indagato (20%) è in accordo con i dati di letteratura. L’analisi di MFN2 mediante MLPA non ha invece permesso di rilevare alcun riarrangiamento genico. Attualmente lo studio dei meccanismi tramite cui mutazioni in MFN2 inducono neurodegenerazione è limitato dal fatto che solo pochi modelli di CMT2A sono stati sviluppati con successo in topo. Considerando che lo zebrafish si è recentemente distinto come un buon modello per lo studio di molte malattie neurodegenerative, si è deciso di investigare la funzione di mitofusina 2 e il suo ruolo nella patogenesi della CMT2A in tale organismo. Mitofusina 2 è stata quindi silenziata durante lo sviluppo di zebrafish usando un oligo-morfolino antisenso, il quale viene direttamente iniettato in uova fecondate. L’analisi del fenotipo dei morfanti ha permesso di evidenziare come, in assenza di mfn2, gli embrioni presentino evidenti alterazioni fenotipiche ed in particolare risultino avere gravi problemi di movimento, in accordo col fenotipo osservato nei pazienti. Ulteriori analisi hanno evidenziato che il sistema neuromuscolare delle larve è gravemente compromesso, con motoneuroni morfologicamente alterati e una riduzione del numero di giunzioni neuromuscolari correttamente formate. Inoltre, come nei pazienti, le fibre muscolari risultano ipotrofiche e con diametro ridotto, probabilmente a seguito della denervazione dei muscoli dei somiti. Tali risultati, validati da esperimenti di rescue con il trascritto umano di MFN2, confermano il ruolo fondamentale di mitofusina 2 nello sviluppo dei motoneuroni e suggeriscono che lo zebrafish può essere uno strumento utile per lo studio in vivo degli effetti delle mutazioni trovate nei pazienti con CMT2. Per tale motivo si è proceduto a mettere a punto un metodo che consentisse di valutare l’effetto delle mutazioni in MFN2 utilizzando lo zebrafish come modello. Ci si è concentrati in primo luogo sull’analisi della mutazione R94Q, la più frequentemente identificata nei pazienti e per la quale sono disponibili svariate informazioni riguardanti il suo meccanismo molecolare, ottenute sia da indagini in vitro che in vivo. Mediante esperimenti di iniezione dell’mRNA umano mutato, sia in presenza che in assenza del morfolino contro mfn2, si è potuto dimostrare che nei primi stadi dello sviluppo di zebrafish, R94Q è, almeno in parte, loss of function. Tale risultato è in accordo con alcuni dati ottenuti da studi in vitro che dimostrano che tale allele mutato di MFN2 non è in grado di ripristinare la forma del network mitocondriale in cellule derivate da topi knock-out per Mfn2. Inoltre una linea di topi knock-in per R94Q non mostra alcun segno patologico quando la mutazione è in eterozigosi, mentre è letale, ma tardivamente rispetto al knock-out, in omozigosi. Tuttavia un solo meccanismo di loss of function non è in grado di spiegare il fatto che una linea transgenica di topi in cui R94Q è sovraespressa nel sistema nervoso mostri un fenotipo compatibile con la CMT2A a partire dai 5 mesi di vita. I dati così ottenuti, confrontati con quelli di letteratura, suggeriscono che R94Q, pur avendo funzionalità ridotta, potrebbe avere anche un effetto di gain of function, il quale però è in grado di manifestarsi solo dopo lo sviluppo embrionale. Va segnalato che il metodo messo a punto, permette di evidenziare alterazioni solo nei primi stadi dello sviluppo e per tale motivo sarà necessario sviluppare delle linee transgeniche stabili di zebrafish per confermare il meccanismo d’azione di R94Q. Questo potrà permettere di ampliare l’indagine anche valutando gli effetti delle mutazioni in MFN2 rilevate con la presente indagine. Nel complesso i dati ottenuti con questo lavoro hanno contribuito a chiarire la possibile correlazione genotipo-fenotipo in pazienti affetti da CMT2A. Inoltre è stato possibile identificare zebrafish come un nuovo strumento per l’analisi del meccanismo d’azione di mutazioni in MFN2 associate a CMT2. Dato che zebrafish è un organismo modello che si presta meglio di altri a esperimenti di drug screening, la validazione di un sistema modello per la CMT2A in zebrafish potrebbe in futuro contribuire all’identificazione di nuovi farmaci efficaci per il trattamento di tale patologia.