Development of new genetic tests: atypical cystic fibrosis and HCV genotyping

I recenti progressi nel campo della genomica umana hanno fortemente influenzato l’approccio diagnostico e terapeutico alle patologie. La biologia molecolare si è affermata come strumento di elezione per la diagnosi non solo di malattie ereditarie ma anche di una grande varietà di processi neoplastici ed infettivi. Tra le metodologie di questa disciplina, il “Reverse Line Blot” (RLB) occupa un posto di rilievo, grazie alla sua versatilità. E’ una tecnologia molto semplice e può essere utilizzata per la routine diagnostica anche da piccoli laboratori, in quanto la strumentazione necessaria è limitata e non eccessivamente costosa. L'obiettivo del nostro progetto è stato quello di sfruttare le potenzialità di questa tecnologia applicandola allo studio di due diverse patologie: una malattia ereditaria (fibrosi cistica atipica) ed una patologia epatica causata dall’infezione del virus dell'epatite C (HCV). Nella prima parte dello studio, abbiamo esplorato le potenzialità della tecnologia RLB per l’identificazione di mutazioni genetiche note, concentrandoci sullo studio della fibrosi cistica atipica. Si tratta di una patologia caratterizzata dagli stessi sintomi della fibrosi cistica (FC), che si presentano però in forma più lieve, con il coinvolgimento solamente di alcuni organi, ed una o nessuna mutazione nel gene CFTR. Questa eterogeneità fenotipica può essere dovuta all’azione di geni modificatori di CFTR, come, per esempio, quelli che codificano il canale epiteliale del sodio (ENaC). Nel corso di questo progetto è stato sviluppato un nuovo test molecolare basato sulla metodologia RLB, per la rilevazione di 9 varianti nei geni ENaC, coinvolte nella FC atipica e precedentemente descritte da altri gruppi. Le performance del metodo sono state valutate analizzando 208 campioni di pazienti con sintomi respiratori o manifestazioni pancreatiche, e 169 individui sani del gruppo di controllo. Tra i pazienti con sintomi respiratori e affetti da FC atipica, recanti una o nessuna mutazione CFTR, abbiamo trovato 7 diverse varianti ENaC: le mutazioni p.S82C-SCNN1B, p.P267L-SCNN1B, p.G294S-SCNN1B, p.E539K-SCNN1B, p.1670-2A>G-SCNN1B, ed i polimorfismi p.W493R-SCNN1A e p.R181W-SCNN1A. In particolare, p.P267L-SCNN1B, p.G294S-SCNN1B, p.E539K-SCNN1B, p.1670-2A>G-SCNN1B mostravano una frequenza significativamente più alta nei pazienti rispetto ai controlli (p <0,05), mentre per le altre varianti non abbiamo rilevato differenze significative tra i 2 gruppi. Invece nel gruppo di pazienti con pancreatiti, abbiamo identificato 3 varianti ENaC (p.W493R-SCNN1A, p.R181W-SCNN1A, p.S82C-SCNN1B), ma le loro frequenze non erano significativamente diverse tra il gruppo degli affetti e quello dei controlli. Nella seconda parte dello studio, abbiamo esplorato le potenzialità della tecnologia RLB per l’identificazione dei ceppi genotipici del virus dell’epatite C. HCV è un virus a RNA, a singolo filamento positivo, i cui ceppi possono essere classificati in 7 genotipi. L’identificazione del genotipo di HCV è essenziale per la gestione terapeutica ed è correlato all’esito della terapia antivirale. La regione non tradotta al 5’ (5' UTR) del genoma di HCV viene utilizzata come target nella maggior parte dei test di genotipizzazione. Tuttavia tale regione, sebbene altamente conservata, si è rivelata non sufficientemente informativa per la distinzione dei sottotipi HCV 1a e 1b, e per la discriminazione dei genotipi 1 dal genotipo 6 (sottotipi da c a l). Nel corso di questo progetto è stato sviluppato un test molecolare per la genotipizzazione di HCV, che consente una buona distinzione tra genotipi e sottotipi. Il metodo è basato sulla retrotrascrizione di due regioni virali (5'UTR e core), seguita dalla genotipizzazione in RLB. Per la valutazione delle performance del nostro test sono stati analizzati 283 campioni di siero: 212 erano positivi per HCV, 71 erano negativi, mentre 8 erano campioni sintetici, e corrispondevano ai rari genotipi 5, 6 a 7a. Come metodi di riferimento sono stati utilizzati un dispositivo CE-IVD che analizza la sola regione 5’UTR ed il sequenziamento della regione virale NS5b. I risultati ottenuti hanno dimostrato che l'utilizzo di due regioni virali per la genotipizzazione consente una migliore discriminazione dei sottotipi 1a e 1b. Su un totale di 145 isolati con genotipo 1, 22 campioni, non sottotipizzati mediante la sola analisi della 5’UTR, sono stati correttamente tipizzati come 1a o 1b grazie all’analisi combinata 5’UTR e core. Inoltre il nostro metodo ha permesso di effettuare la sottotipizzazione di altri 8 campioni, per i quali l’analisi della sola 5’UTR aveva assegnato una tipizzazione non corretta. Per quanto riguarda i campioni con genotipo 6, il test sviluppato è stato in grado di tipizzarne correttamente 5, che erano stati erroneamente definiti come genotipo 1 mediante l’analisi della sola regione 5’UTR. Il nostro test ha evidenziato una specificità diagnostica del 100% e una sensibilità del 98,6%, sia a livello di genotipizzazione che di sottotipizzazione, in un range di carica virale compreso tra 1 x 10^3 and 6 x 10^7 UI/mL. Pertanto, l'analisi combinata delle due regioni 5'UTR e core determina un’accurata discriminazione tra i sottotipi 1a e 1b, e tra i genotipi 1 e 6, e diventa uno strumento molto importante per l'applicazione del regime terapeutico più appropriato. In conclusione, il nostro lavoro ha dimostrato che la tecnologia RLB è un metodo affidabile per la diagnosi di molte patologie, per le quali si renda necessaria una caratterizzazione genetica. Va però sottolineato che dispositivi basati sulla metodologia RLB possono diventare validi strumenti diagnostici solo per malattie ben caratterizzate da un punto di vista genetico.