A novel Yap/Taz zebrafish reporter reveals a role of Hippo pathway transducers in angiogenesis

YAP e TAZ, orchestrando la proliferazione, la morte e il differenziamento cellulari, rappresentano elementi chiave di una complessa rete di vie di segnalazione che agiscono durante lo sviluppo. L’alterazione della segnalazione YAP/TAZ causa una crescita fuori controllo degli organi durante l’organogenesi, che si traduce nella perdita dell’omeostasi tissutale nell’adulto e conseguente sviluppo tumorale. YAP/TAZ sono co-attivatori trascrizionali che interagiscono con i fattori di trascrizione TEAD per promuovere la proliferazione e la sopravvivenza cellulari. La loro attività trascrizionale è regolata dal trasporto nucleo-citoplasmatico e dall’accumulo nucleare, che sono controllati dalla cascata chinasica della via di Hippo, ma anche dagli stimoli meccanici percepiti dalla cellula e da altre vie. Fra queste, la via di Wnt/β-catenina assume una particolare rilevanza, dal momento che è stato recentemente dimostrato che essa regola l’attività di YAP/TAZ attraverso il loro sequestro nel complesso di degradazione della β-catenina mediato da AXIN. In questa tesi vengono descritte la generazione, la validazione e la caratterizzazione di un nuovo zebrafish biosensore che riporta l’attività di Yap/Taz. Esso esprime le proteine mCherry nucleare, eGFP o la proteina verde fluorescente destabilizzata VenusPEST sotto il controllo di un frammento promotoriale del gene umano CTGF target di YAP/TAZ, contenente 3 siti di legame per TEAD. Sono stati identificati diversi pesci fondatori indipendenti in grado di trasmettere il transgene alla linea germinale, i quali sono stati utilizzati per instaurare le linee reporter stabili. Tutti i pesci transgenici condividevano un pattern di espressione similare, mantenuto nelle generazioni successive. Per validare il reporter sono stati usati approcci di downregolazione e overespressione. La co-iniezione di due morfolini diretti contro i pre-mRNA di Yap e Taz ha ridotto il segnale reporter, mentre l’iniezione di mRNA codificanti per una forma costitutivamente attiva di Yap, Taz o Tead (YAP-5SA, TAZ-4SA, TEAD-VP16) lo ha aumentato. Le linee transgeniche basate sul gene CTGF rappresentano perciò bona fide dei reporter dell’attività di Yap/Taz. Durante lo sviluppo, un forte segnale reporter è visibile principalmente nella lente, la vescicola otica, gli archi faringei, il cuore, la pinna pettorale e la rete vascolare, ma l’espressione della proteina reporter è rilevabile in molti altri tessuti e organi. L’attivazione quasi ubiquitaria di Yap/Taz osservata durante l’embriogenesi precoce, consistente con il ruolo generale di YAP/TAZ nel promuovere la proliferazione cellulare e la crescita degli organi, è ampiamente silenziata nel pesce adulto, dove il segnale reporter è ristretto a lente, ovario, cuore e intera rete vascolare. Lo zebrafish biosensore è anche in grado di riportare l’attivazione di Yap/Taz durante la rigenerazione della coda nella larva e nell’adulto, come atteso dal ruolo che riveste la segnalazione YAP/TAZ nei processi rigenerativi. Lo zebrafish reporter basato sul gene CTGF ha permesso di mostrare in un organismo vivente durante lo sviluppo la regolazione che la via di Wnt/β-catenina esercita sull’attività di Yap/Taz. I nostri risultati in termini di variazione del segnale reporter, in seguito alla modulazione genetica e farmacologica dell’attività della via di Wnt, sono in linea con il modello disegnato di recente in vitro. L’attività generale e sostenuta del reporter nell’endotelio durante l’embriogenesi ha suggerito un coinvolgimento funzionale della segnalazione Yap/Taz nell’angiogenesi precoce. La downregolazione di Yap/Taz è risultata in una compromissione della crescita dei vasi intersegmentali (ISVs), mentre l’attivazione spinta della trascrizione mediata da Yap/Taz ha causato un ramificarsi anomalo degli ISVs. La capacità di Yap/Taz di promuovere tale ramificazione vascolare è “cell-autonomous”, dal momento che lo stesso fenomeno è stato osservato esprimendo TAZ-4SA sotto il controllo di un promotore endotelio-specifico. Lo zebrafish reporter sviluppato è un nuovo potente strumento per studiare in vivo l’attivazione della via di Yap/Taz, con possibili applicazioni nello screening farmacologico e nella biologia della rigenerazione e del cancro. Ha permesso di confermare in vivo durante lo sviluppo l’interazione fra le vie di Wnt/β-catenina e Yap/Taz e di scoprire un nuovo ruolo di Yap/Taz nella ramificazione vascolare, suggerendo una funzione pro-angiogenica dell’attività trascrizionale di YAP/TAZ.