Caratterizzazione del decorso della patologia tramite biomarcatori e impiego di ligandi bivalenti come strategia per monitorare e modulare la neuroinfiammazione nella SLA.

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease marked by the progressive loss of motor neurons (MNs). Due to its clinical variability, diagnosis is often delayed, while pathological changes begin well before symptom onset. Therefore, biomarker discovery is crucial for early diagnosis and monitoring. Among them, neurofilament light chain (NF-L) has supported the approval of Tofersen for SOD1-linked ALS. Preclinical rodent models are essential for understanding disease mechanisms and testing therapies. In the first part of this PhD project, we used the SOD1G93A rat model, which reflects clinical heterogeneity, to define disease stages using complementary biomarkers High-resolution T2-weighted MRI with respiratory gating and z-score analysis revealed hyperintensities in the facial and trigeminal—but not hypoglossal—motor nuclei from week 18, prior to symptom onset. Immunofluorescence confirmed glial activation and reduced neuronal numbers in all three nuclei. NF-L levels were significantly increased in cerebrospinal fluid (CSF) from the cisterna magna at pre-symptomatic stages, indicating early neurodegeneration. Although proton density MRI did not reveal spinal cord changes at equivalent stages, histology confirmed neuronal loss in lumbar segments, correlating with hindlimb deficits. We also mapped gliosis and TSPO (18 kDa translocator protein) expression in cervical and lumbar spinal cords. TSPO upregulation, localized to reactive microglia clusters, may reflect neuroinflammation, though its function remains unclear. TSPO ligands can promote anti-inflammatory microglial states, while the Sigma-1 receptor (S1R), also expressed in early-stage ALS, is a known modulator of cell stress and inflammation. Since TSPO and S1R are both localized at mitochondria-associated membranes (MAMs), we hypothesized that dual-targeting ligands could provide synergistic therapeutic effects. In the second part of the project, we characterized multi-target-directed ligands (MTDLs) combining PK11195 (TSPO ligand) and RC33 (S1R agonist) pharmacophores. Binding studies confirmed receptor selectivity. BiP-dissociation assays demonstrated S1R agonism with improved specificity over RC33. Given PK11195’s role in promoting glial steroidogenesis, we tested MTDLs’ ability to induce pregnenolone production in C6 and BV2 cells. MTDLs outperformed reference ligands at equimolar doses. In BV2 cells with TSPO knockdown (BV2.106), pregnenolone production was markedly reduced, confirming TSPO dependence. S1R knockdown led to an even greater reduction, suggesting synergy in regulating steroidogenesis. We then used HMC3 human microglial cells and developed a stable TSPO-overexpressing line (TSPO-GFP), combined with transient S1R overexpression for imaging. MTDLs altered cell morphology and the intracellular localization of both proteins. Imaging suggested potential zones of interaction between TSPO+ mitochondria and S1R-enriched regions, supporting their functional proximity. Overall, these results highlight the value of combining imaging and molecular approaches to define disease stages and cellular responses in ALS models. Our findings support the potential of dual S1R/TSPO ligands to modulate microglial function and promote neuroprotection in ALS.

Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa fatale caratterizzata dalla progressiva perdita dei motoneuroni (MN). A causa dell’elevata variabilità clinica, la diagnosi è spesso ritardata, mentre le alterazioni patologiche iniziano molto prima della comparsa dei sintomi. Per questo motivo, l’identificazione di biomarcatori risulta fondamentale per la diagnosi precoce e il monitoraggio della malattia. Tra questi, i neurofilamenti leggeri (NF-L) hanno supportato l’approvazione del Tofersen come terapia per le forme di SLA associate a mutazioni del gene SOD1. I modelli preclinici nei roditori sono strumenti chiave per lo studio dei meccanismi patogenetici e per la sperimentazione di nuove terapie. Nella prima parte di questo progetto di dottorato, abbiamo utilizzato il modello di ratto SOD1G93A, che riflette la variabilità clinica della SLA, per definire gli stadi della malattia attraverso l’uso di biomarcatori complementari. L’analisi MRI T2 ad alta risoluzione, ha rivelato iperintensità nei nuclei motori del facciale e del trigemino—ma non in quello dell’ipoglosso. L’immunofluorescenza ha confermato l’attivazione gliale e la riduzione del numero di neuroni in tutti e tre i nuclei. Alterazioni nei livelli di NF-L nel liquido cerebrospinale (CSF) risultavano già significativamente aumentati in fase pre-sintomatica, indicando una neurodegenerazione precoce. Nonostante le criticità della proton density MRI sul midollo spinale di ratto, l’analisi istologica ha confermato la perdita neuronale nei segmenti lombari, in correlazione con il deficit motorio agli arti posteriori. Abbiamo inoltre mappato la gliosi e l’espressione di TSPO (Translocator Protein 18 kDa) nei tratti cervicale e lombare del midollo spinale. L’aumento di TSPO, localizzato in cluster di microglia reattiva, potrebbe riflettere uno stato neuroinfiammatorio, sebbene il suo ruolo resti controverso. I ligandi di TSPO possono indurre stati microgliali anti-infiammatori, mentre il recettore Sigma-1 (S1R), anch’esso espresso in fase precoce di SLA, è un noto modulatore dello stress cellulare e dell’infiammazione. La distribuzione di TSPO e S1R in corrispondenza delle membrane associate ai mitocondri (MAMs), è alla base dell’ipotesi che ligandi dual-target (MTDLs) possano avere effetti terapeutici sinergici. Nella seconda parte del progetto, abbiamo caratterizzato MTDLs che combinano i farmacofori di PK11195 (TSPO) e RC33 (S1R). Studi di binding hanno confermato la selettività recettoriale. I saggi di dissociazione di BiP hanno dimostrato agonismo S1R con una specificità superiore rispetto a RC33. Dato il ruolo di PK11195 nella steroidogenesi gliale, abbiamo testato la capacità degli MTDLs di indurre la produzione di pregnenolone nelle cellule C6 e BV2. Gli MTDLs hanno superato i ligandi di riferimento a dosi equimolari. Nelle BV2 con knockdown di TSPO (BV2.106), la produzione di pregnenolone è risultata fortemente ridotta, confermando la dipendenza da TSPO. Il knockdown di S1R ha comportato una riduzione ancora maggiore, suggerendo una sinergia nel controllo della steroidogenesi. Infine, utilizzando cellule microgliali umane HMC3, abbiamo sviluppato una linea stabile con over-espressione di TSPO-GFP, combinata a un’iperespressione transitoria di S1R favorirne la marcatura tramite anticorpo primario. Gli MTDLs hanno modificato la morfologia cellulare e la localizzazione intracellulare di entrambe le proteine. L’imaging ha suggerito potenziali zone di interazione tra mitocondri TSPO+ e regioni arricchite in S1R, a supporto di una loro prossimità funzionale. Nel complesso, questi risultati sottolineano l’importanza dell’integrazione tra approcci molecolari e di imaging per la definizione degli stadi di malattia e delle risposte cellulari nei modelli di SLA e supportano il potenziale terapeutico dei ligandi duali S1R/TSPO nel modulare la funzione microgliale e promuovere la neuroprotezione nella SLA.