In vivo analyses of morphogen signalling pathways using Zebrafish transgenic reporter lines

Diversi segnali chimici regolano il direzionamento delle cellule e il loro differenziamento durante lo sviluppo embrionale. Alcuni di questi vengono definiti come morfogeni, perché agiscono creando un gradiente nell'embrione e determinano una risposta diversa nelle cellule a seconda della concentrazione percepita. BMP, TGFb, Wnt e Shh sono riconosciuti come morfogeni. Nelle cellule che ricevono uno di questi segnali si attiva una cascata trasduzionale che termina con l'attivazione di specifici fattori di trascrizione. Questi segnali svolgono un ruolo importante anche negli adulti, controllando i processi di rigenerazione e mantenendo l'omeostasi dei tessuti. E' noto che una loro alterazione è associata a malattie di vario tipo, come il cancro e patologie con una risposta infiammatoria anomala. Lo zebrafish può essere un utile strumento per lo studio di questi segnali. La trasparenza degli embrioni e la fecondazione extra-utero ne rende possibile la manipolazione genetica e chimica. Il nostro laboratorio ha sviluppato alcune linee reporter per lo studio di questi morfogeni. Lo scopo di questa tesi è stato prima di tutto validare e caratterizzare queste linee, soffermandoci in particolare sulla linea responsiva al TGFb/smad3. Dopo la loro validazione, queste linee sono state impiegate per lo sviluppo di 2 progetti: - la comprensione del ruolo dello smad3 nello sviluppo del sistema nervoso centrale - la comprensione delle interazione trai 4 citati morfogeni e le vie di segnale del Notch e del FGF durante lo sviluppo larvale precoce E' stato dimostrato che l'espressione del reporter legata allo smad3 si localizza principalmente nel parte più interna del sistema nervoso. Studi di colocalizzazione hanno mostrato che il reporter è espresso da cellule gliali e neuronali che stanno differenziando. Inoltre, sia l'inibizione chimica sia il knock-down dello smad3 causano un aumento dei progenitori accompagnato da una diminuzione dei precursori e di cellule mature come i motoneuroni e gli oligodnedrociti. Il saggio di proliferazione con l'EdU ha mostrato che il reporter è espresso in cellule post-mitotiche non proliferanti. L'inibizione del smad3/TGFb porta a un aumento delle cellule proliferanti e altera il processo di transizione da epiteliale a mesenchimale che può essere responsabile dell'errato posizionamento dei motoneuroni. Inoltre, entrambi i paraloghi dello smad3, smad3a e b, trovati in zebrafish, sembrano avere un simile ruolo nel regolare il differenziamento neurale come dimostrato dall'effetto similare determinato dal knock-down di entrambi. Per studiare le interazione trai segnali chimici le corrispondenti linee reporter sono state trattate a 24 hpf con le molecole che agiscono in modo specifico su ciascuno di essi. Gli effetti sull'espressione del reporter sono stati innanzitutto valutati al microscopio a fluorescenza. Questi risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti con l'analisi del trascritto della GFP tramite ibridazione in situ. Per ottenere dei dati oggettivi, la fluorescenza è stata quantificata con il software ImageJ. I risultati ottenuti hanno permesso di ricavare uno schema di interazioni trai segnali chimici durante lo sviluppo larvale precoce. L'analisi al microscopio confocale ha permessso l'analisi d'espressione temporale e spaziale reciproca delle varie vie di segnale. Come ulteriore dimostrazione dell'applicazione in vivo delle linee transgeniche, è stato effettuato uno studio preliminare del ruolo dei morfogeni nello sviluppo del pancreas. Incrociando le linee reporter prima descritte con transgenici esprimenti un reporter nel pancreas endocrino o esocrino, in precursori o cellule mature, è stato possibile rilevare il coinvolgimento del Shh nello sviluppo dell'isola pancreatica e l'attivazione del BMP nel sistema vascolare pancreatico, dove sembra coinvolto nel controllo dell'angiogenesi e nel corretto posizionamento dell'isola stessa, come dimostrato dagli studi funzionali. In conclusione, le linee qui illustrate rappresentano un nuovo e interessante modello per la ricerca in diversi campi biologici. Consento di seguire processi dinamici sia in condizioni fisiologiche sia patologiche in vivo. Inoltre sono perfettamente responsive ai segnali per cui sono state create e possono complementare gli studi in vitro.