The dynamic changes of expression signatures in the larval development of mytilus gallopronvincialis

I bivalvi sono la classe di organismi marini più studiata, sia per il loro ruolo ecologico di bioindicatori del grado di inquinamento costiero, sia per la loro rilevanza economica nel settore alimentare. Il loro sviluppo larvale è caratterizzato da una rapida crescita e da profondi cambiamenti morfologici e metabolici volti al raggiungimento dello stadio adulto. I radicali mutamenti a cui l’organismo va incontro sono riconducibili all’espressione coordinata di specifici geni. Lo scopo del mio progetto di dottorato è stato quello di definire i profili trascrizionali associati a ciascuno dei 6 stadi di sviluppo larvale di Mytilus galloprovincialis per far luce sui processi biologici alla base dell sviluppo larvale. Nel 2009 abbiamo riprodotto in laboratorio il naturale processo di fecondazione tra 8 femmine e 20 maschi inducendo l’emissione dei gameti. Abbiamo quindi raccolto campioni di RNA totale dell’uovo fecondato e di ciascuno stadio larvale e abbiamo inoltre conservato in paraformaldeide alcune larve per effettuare esperimenti di ibridazione in situ. A partire dall’RNA totale estratto abbiamo allestito sette librerie stadio specifiche costituite da frammenti 3’ terminali di cDNA. Queste sono state sequenziale con le moderne tecnologie di sequenziamento massivo così da ottenere sia le sequenza di trascritti espressi durante gli stadi larvali, sia una stima del loro profilo di espressione nei vari stadi larvali calcolando la loro frequenza di rappresentazione in ciascuna libreria. Per il sequenziamento ci siamo avvalsi della tecnologia 454 (Roche) che ci ha permesso di ottenere 751,872 reads caratterizzate da una lunghezza mediana di 315 bp. Le reads ottenute sono state assemblate con sequenze prodotte precedntemente dal nostro laboratorio e depositate su MytiBase ottenendo 14,364 sequenze consensus e 55,493 singletons. Quindi abbiamo calcolato il numero di reads che si allineano con ciascun trascritto in ciascuna libreria stadio specifica così da ottenere una stima dei profili trascrizionali associati a ciascuno stadio di sviluppo larvale. Sfruttando un algoritmo da noi sviluppato siamo riusciti ad annotare il 55% dei trascritti. Per verificare l’attendibilità delle conte come mezzo per stimare l’espressione genica abbiamo eseguito una serie di esperimenti di PCR quantitativa su un nuovo campionamento biologico eseguito all’inizio del 2011. Sulla base dell’elevata correlazione tra i dati di espressione stimati con le due tecnologie indipendenti possiamo giudicare affidabile il nostro approccio. Tramite un test binomiale negativo abbiamo determinato che il 25% dei trascritti risulta differenzialmente espresso in almeno due stadi di sviluppo. Inoltre le maggiori differenze di espressione si rilevano confrontando gli stadi precoci (troco fora e larva D) con quelli tardivi (larva umbonata, pediveliger e larva metamorfica). Mediante analisi di Gene Ontology abbiamo individuato i processi biologici maggiormente implicati nello sviluppo larvale quali ad esempio il controllo della crescita, lo sviluppo degli organi e i processi di biomineralizzazone e sintesi del bisso. Infine stiamo eseguendo degli esperimenti di ibridazione in situ per incominciare la caratterizzazione di alcuni dei geni, differenzialmente espressi ma non annotati, definendo la loro localizzazione. Concludendo, abbiamo ottenuto la prima stima dei profili trascrizionali associati a ciascuno stadio larvale di M. galloprovincialis per comprendere i meccanismi molecolari su cui fonda il processo di sviluppo larvale.