Development and validation of in vitro diagnostic devices for HPV detection and genotyping

Oggetto di questa tesi è il lavoro svolto presso l’azienda AB ANALITICA s.r.l. nell’ambito di un Dottorato di Ricerca in Alto Apprendistato, una forma innovativa di dottorato che mira ad avvicinare il mondo dell’università a quello del lavoro. Nella prima parte del mio percorso di dottorato ho lavorato ad un progetto che aveva come obbiettivo lo sviluppo di una nuova versione del prodotto REALQUALITY RI-HPV STAR, un dispositivo per la rilevazione dell’HPV commercializzato da AB ANALITICA. La nuova versione doveva innanzitutto corrispondere ai criteri di sensibilità analitica definiti dalla World Health Organization (WHO) per i dispositivi di genotipizzazione dell’HPV. La tecnologia su cui si basa il dispositivo originale, e su cui, pertanto, si sarebbe dovuta basare la nuova versione, è la PCR Real-time con intercalante e analisi delle Curve di Melting. I primer utilizzati nella mix del prodotto originale sono i primer GP5+/GP6+. Si tratta di primer consensus che permettono di amplificare la maggior parte dei genotipi (o “tipi”) di HPV in aggregato. La sensibilità analitica di un sistema basato su questi primer non è omogenea rispetto ai diversi tipi di HPV identificabili e, per alcuni di essi, è inferiore a quanto richiesto dal WHO. Per prima cosa, si è stabilito di aggiungere altri primer alla coppia originale. In conseguenza di ciò, si è reso necessario l’impiego di reagenti idonei ad una reazione con molteplici primer ed, alla fine, l’intero assetto del saggio è stato modificato. Con l’occasione si è deciso di modificare un altro aspetto del saggio ed amplificare in multiplex, invece che in due reazioni distinte, il target patogeno ed il controllo interno. Lo scopo di ottenere un più alto livello di sensibilità analitica è stato raggiunto. Tuttavia, nel corso della pre-validazione del nuovo prototipo, sono emerse delle problematiche relative allo sviluppo di dimeri di primer che rischiavano di compromettere la corretta interpretazione dei risultati e che hanno portato alla sospensione del progetto. Nella seconda parte del mio dottorato ho lavorato alla progettazione, allo sviluppo e alla validazione di altri due dispositivi per la rilevazione dell’HPV, basati, questa volta, su PCR Real-time con primer genotipo-specifici e sonde di tipo TaqMan. I genotipi di HPV rilevati dal primo dei due saggi sono i 14 genotipi ad alto rischio più diffusi ovvero HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68. Il secondo saggio rileva invece la presenza dei due HPV a basso rischio più diffusi, HPV 6 e 11, e di altri HPV a possibile alto rischio, ovvero HPV 26, 53, 67, 70, 73 e 82. Il primo saggio è già stato validato e le sue performance rientrano abbondantemente nei parametri stabiliti dal WHO e dal piano di validazione redatto in azienda. Tale saggio risulta, quindi, pronto per essere commercializzato come dispositivo per la detection degli HPV ad alto rischio con il nome REALQUALITY RQ-HPV HR MULTIPLEX. La validazione del secondo saggio è in corso, ma i primi dati sono promettenti. Il secondo saggio, se associato al primo, permette di offrire un pannello di indagine dell’HPV estremamente completo. Accanto al prodotto corrispondente al primo saggio, ne verrà, pertanto, proposto un secondo, corrispondente ai due saggi associati. Tale prodotto prenderà il nome di REALQUALITY RQ-HPV HR/LR MULTIPLEX.