Genomic instability at common fragile site FRA3B in normal human cells in the absence of aphidicolin-induced replication stress

I siti fragili sono loci che presentano interruzioni cromatiche (gap) o rotture in cromosomi di cellule esposte a parziale inibizione della replicazione del DNA. Queste regioni genomiche possono essere classificate in rare e comuni sulla base della frequenza di 'espressione' (ossia rottura cromosomica) nella popolazione. Queste due classi si distinguono inoltre per il meccanismo di induzione in vitro della rottura (Durkin and Glover, 2007; Lukusa and Fryns, 2008). I siti fragili rari sono presenti in meno del 5% della popolazione e sono caratterizzati dalla presenza di ripetizioni di- o tri-nucleotidiche. Essi segregano in maniera mendeliana e la loro espressione può essere associata a fenotipi patologici. I siti fragili comuni sono una componente normale della struttura dei cromosomi, tuttavia la loro probabilità di espressione citogenetica è variabile da individuo ad individuo. Una questione chiave riguarda la loro possibile stabilità in vivo in condizioni fisiologiche. I siti fragili comuni non presentano una chiara sequenza consenso (motivi ripetuti), ma contengono tratti ricchi in ripetizioni dinucleotidiche AT in grado di creare strutture secondarie che potrebbero interferire con la progressione della forca replicativa (Mishmar et al., 1998; Lukusa and Fryns, 2008). Questa caratteristica correla con l'espressione d'instabilità ai siti fragili in quanto le strutture secondarie possono indurre rotture a doppio filamento. FRA3B è il sito fragile comune più attivo nel genoma umano; esso è localizzato sul cromosoma 3 in posizione p14.2 (Saldivar et al., 2010) e il centro di fragilità (core) è definito in FHIT, gene oncosoppressore (Durkin et al., 2008). Tale gene è riarrangiato in diversi tumori, e la maggior parte delle alterazioni sono delezioni sub-microscopiche da 10 a 100 kb che possono essere legate a condizioni di stress replicativo (Durkin et al., 2008). In questo lavoro, tramite microscopia a fluorescenza su singole molecole elongate di DNA (molecular combing), sono stati studiati sia la stabilità della sequenza di FRA3B che il suo profilo di replicazione in diverse cellule umane, in assenza di stress replicativo indotto da afidicolina. Esperimenti di ibridazione in situ fluorescente (FISH) su molecole stese di DNA permette di analizzare regioni genomiche specifiche e di valutare la loro possibile instabilità, in quanto la posizione tra le sonde riflette la reale distanza lungo le molecole (Michalet et al., 1997). Due sonde marcate con nucleotidi differenti sono state usate per studiare la stabilità genomica del core di fragilità di FRA3B e hanno dimostrato la presenza di una piccola ma rilevante percentuale di pattern con ibridazione anomala (1-14%) in cellule cresciute in condizioni fisiologiche. Inoltre sono stati osservati tre casi di duplicazione di sequenza. In linfociti stimolati e non stimolati di sangue periferico di donatori sani e in linee cellulari linfoblastoidi sono state osservate proporzioni simili di sequenze anomale (circa 11%). La presenza di questi pattern in linfociti non stimolati indica che queste anomalie di sequenza sono presenti in vivo anche in assenza di proliferazione cellulare. E' possibile così escludere un effetto della coltura in vitro. Questi pattern anomali non sono una caratteristica specifica delle cellule linfoblastoidi in quanto risultano presenti anche in fibroblasti umani (IMR-90). Inoltre, confrontando differenti passaggi in coltura, si può osservare una tendenza all'aumento di questi pattern che suggerisce una possibile correlazione con l'attività proliferativa in normali condizioni di crescita. Per confermare la specificità di sequenza delle nostre osservazioni, con lo stesso approccio di FISH a doppio colore sono stati analizzati una regione non fragile e un altro sito fragile comune (FRA6E). Questi dati dimostrano che le anomalie di sequenza osservate sono specifiche per il locus FRA3B. La bassa frequenza e unicità di queste anomalie in ogni popolazione cellulare analizzata non ci permette di usare tecniche di sequenziamento per chiarire il loro significato biologico. In alternativa, in questo studio sono state allestite 59 popolazioni clonali da cellule linfoblastoidi TK6 per monitorare la frequenza di queste anomalie di sequenza. Lo studio è stato effettuato su quattro di questi cloni cellulari campionati a caso, a due tempi di coltura diversi (18 e 38 giorni). I dati dimostrano una diminuzione significativa della proporzione di anomalie al primo tempo di raccolta rispetto alla popolazione di partenza, e analizzando i risultati ottenuti al secondo intervallo definito emerge una tendenza all'aumento. Quest'analisi suggerisce che l'instabilità di FRA3B avviene nella progenie di una cellula normale durante la proliferazione e potrebbe causare un progressivo accumulo di sequenze anomale ed eterogenee tra loro. In questo lavoro inoltre è stato verificato, con un approccio simile al precedente, una specifica fragilità di FRA3B in fase di molecular combing. Questo effetto potrebbe essere dovuto alla presenza di strutture secondarie favorenti la formazione di rotture durante l'estensione delle molecole di DNA. Con la tecnica del molecular combing è anche possibile valutare la dinamica di replicazione della popolazione cellulare sia a livello dell'intero genoma che a livello del singolo locus mappando le origini di replicazione e calcolando la velocità delle forche replicative e la distanza tra le origini. Inoltre le forche possono essere classificate come bidirezionali, unidirezionali, in pausa o arrestate e asincrone (Schurra and Bensimon, 2008). Queste analisi sono state effettuate su linfociti e fibroblasti primari. A livello dell'intero genoma, inaspettatamente una frazione significativa, che varia in base al tipo cellulare, è rappresentata da forche unidirezionali. Inoltre questo parametro di replicazione aumenta nelle IMR-90 in relazione ai passaggi in coltura. I dati sulla velocità delle forche e sulle distanze tra origini confermano che i due parametri replicativi sono strettamente correlati (Conti et al., 2007). Sebbene FRA3B sia un locus a replicazione tardiva, caratteristica legata all'espressione di fragilità (Wang et al., 1999), l'analisi non ha evidenziato parametri replicativi anomali o specifici delle regioni che replicano tardivamente, in accordo con quanto è già stato pubblicato nel nostro laboratorio riguardo al sito fragile, FRA6E (Palumbo et al., 2010). Infatti i parametri di replicazione a livello di singole regioni genomiche (fragili o non fragili) sono caratterizzati da differenze comuni (in particolare forche replicative lente e distanze tra origini elevate) rispetto ai dati osservati a livello di intero genoma, ma non si osservano profili di replicazione specifici per i siti fragili comuni. Recenti studi hanno dimostrato una possibile relazione tra l'attività trascrizionale di lunghi geni associati ai siti fragili comuni, incluso FHIT, e la loro instabilità (Helmrich et al., 2011). Valutando l'attività trascrizionale di FHIT nelle stesse linee cellulari analizzate per molecular combing, ci è possibile suggerire una correlazione con le anomalie di sequenza in quanto nei fibroblasti l'attività è molto bassa come anche la proporzione di pattern di sequenza anomali. FRA3B è altamente conservato e Fra14A2 è l'ortologo murino (Helmrich et al., 2006) che potrebbe essere un modello interessante per capire i meccanismi di instabilità dei siti fragili comuni umani. In questo lavoro sono state definite le condizioni richieste per avviare lo studio sull'ortologo murino di FRA3B con la tecnica del molecular combing ed è stato sviluppato un protocollo per elongare molecole di DNA di gameti maschili. La dinamica di replicazione a livello di intero genoma su fibroblasti embrionali murini (MEF) è risultata confrontabile con quella osservata su fibroblasti umani. Inoltre, attraverso la FISH a doppio colore, l'instabilità genomica di Fra14A2 sullo stesso tipo cellulare viene confermata e dati preliminari suggeriscono la presenza di instabilità di Fra14A2 anche in spermatozoi maturi, che potrebbe rappresentare un possibile fattore di rischio genetico per la progenie. Questo studio riporta una prima osservazione diretta di instabilità genomica ai siti fragili comuni in cellule normali cresciute in condizioni fisiologiche. E' importante evidenziare inoltre che le stesse anomalie di sequenza qui descritte potrebbero rimanere non analizzabili e non interpretabili in analisi genomiche a causa della loro bassa frequenza ed eterogeneità.